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MTT法测定细胞增殖或者细胞毒性实验

作者:伟佛修缘   (离线)   [mtt ]   [肿瘤细胞 ]   时间:2016-09-14 13:47:08  向他请教

普通mtt方法步骤:

1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000 个细

胞(细胞浓度的问题见后面的注意事项)接种到96 孔板,每孔体积200ul.

2: 培养细胞:同一般培养条件,培养3-5 天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3:呈色:培养3-5 天后,每孔加MTT 溶液(5mg/ml 用PBS 配制,pH=7.4)10ul.继续孵育4

h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加100ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解。

4:比色:选择490nm 波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为

横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线

药物


改进方法(详细):

1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度1000- 10000

/孔,(细胞浓度的问题见后面的注意事项)。

2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96 孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,

细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午)加

药.一般5-7 个梯度,每孔100ul,设3-5 个复孔.建议设5 个,否则难以反应真实情况

3: 5%CO2,37℃孵育16-48 小时,倒置显微镜下观察。

4: 每孔加入10ulMTT 溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT 能够反

应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS 冲2-3 遍后,再加入含MTT 的培养液。

5: 终止培养,小心吸去孔内培养液。

6: 每孔加入100ul 二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫

检测仪OD490nm 处测量各孔的吸光值。

7: 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介

质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。


注意事项:

(1) 选择适当得细胞接种浓度和培养时间。

一般情况下,96 孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105 个细胞。但由于不同细胞贴壁

后面积差异很大,因此,在进行MTT 试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及

不同接种细胞数条件下的生长曲线,确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间,以防止细胞

过满。这样,才能保证MTT 结晶形成的量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性

降低,太少观察不到差异。因此,很多高手总结出“宁少勿多”的原则,这一原则在大多数

情况下是适用的。

对于体积小,增殖慢、悬浮的细胞,在 96 孔板中可以接种更多数目的细胞。甚至可以

超过105 个/孔。同时,为了观察药物对这类细胞的效果,可以较上一种细胞培养更长时间。

(2) 设置调零孔(只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul)。

(3) 设置空白孔(细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul 二甲基亚砜)。

(4) MTT 实验吸光度最后要在0-0.7 之间,超出这个范围就不是直线关系。

(5) 96 孔板边缘32 孔用无菌PBS 填充,因为边缘的32 孔中水分蒸发很快,药物易被浓缩,

对实验影响大。同时加入pbs 液填充后,可以一定程度上保持中间孔的水分。

(6)防止药物与MTT 反应。

如果 96 孔板中加入了具有氧化还原性的药物,比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建议你用PBS

将细胞洗洗,否则这些药物会将MTT 还原成棕褐色沉淀,这种效果可能是你不需要的。

(7) 吸收值分析

在理想的 MTT 实验中,如果是细胞抑制实验,不加药物处理的空白组的吸收值应该在

0.8-1.2 左右,太小检测误差占的比例较多,太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理

在朗伯-比尔定律中有解释。

(8)培养过程中换液

100ul 的培养液对于10 的4~5 次方的增殖期细胞来说,很难维持50h 以上,如果营养

不够的话,细胞会由增殖期渐渐趋向G0 期而趋于静止,影响结果。如果培养时间长,在48h

应该换液一次。

(9) 避免血清干扰

高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一

般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液。

(10)判断污染

如加入 MTT 后都有个别孔立即变为蓝黑色,则污染的可能性極大。在加MTT 前可以

先在镜下观察,看看是否有孔染菌,染菌的孔常常是临近的。

(11)加DMSO 前要把液体小心吸掉

但培养液里的紫色结晶可能会吸去,可在这之前先用平板离心机离心96 孔板,2000r,

5 分钟,然后吸掉上清(如果是悬浮细胞,则推荐此法,悬浮细胞要离心2500rpm×10min.且

其做MTT 最好用圆底型96 孔板,清除上清时注意不要把下面的结晶颗粒吸掉。

对于贴壁细胞,可以试着将 96 孔板倾斜30 度角,然后用枪尖慢慢吸。




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