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实时荧光定量PCR

作者:伟佛修缘   (离线)   [生物化学 ]   [PCR ]   时间:2016-09-28 10:43:26  向他请教

最近一直再做RT-PCR,把自己的心得体会分享给大家,RT-PCR实验步骤不是很难,其实最关键的是最后的分析问题。

RT-PCR也称为实时荧光定量PCR,该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。pcr1.jpg

荧光定量PCR与普通PCR的主要区别:常规PCR中,PCR产物通过凝胶电泳,然后进行成像分析,常规PCR只能通过终点法对扩增产物进行定性分析,而不能进行定量分析(图2);荧光定量PCR中,PCR反应体系中加入了荧光分子,通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化,使PCR产物的实时检测成为可能。pcr2.jpg

荧光定量PCR的几个基本概念:

1:扩增曲线:为了更好的理解荧光定量PCR原理,我将用样品扩增曲线来进行说明。描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线,而是呈S型曲线(图3)。图3中,X-轴表示PCR循环数,Y-轴表示扩增反应的荧光值,与反应管中扩增产物的量有比例关系。

pcr3.jpg

从图3可以很直观的看出,荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段(基线期),荧光信号指数扩增阶段(对数期)和平台期。在基线期,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,我们无法判断产物量的变化。而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。

2荧光阈值

在介绍荧光阈值之前,先了解一下荧光本底信号(图3),我们一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline,基线期),即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍(机器自动设置)。我们在做荧光定量PCR实验时,经常采用手动设置,手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,真正的信号是荧光信号超过域值(图4)。

pcr4.jpg

3 Ct值

了解了荧光阈值的概念后,Ct值就很好理解了。C代表Cycle,t代表threshold,所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中,当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如图3所示,黑色的线显示的是荧光阈值,当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct值。从这也可以了解到Ct值是可以变化的,我们实验时带有一定的人为因素。而荧光定量PCR后面的数据处理要用到Ct值来计算,所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来,新手按荧光PCR仪的自动设置为好,而如果你非常有经验,一般会手动设置荧光阈值。因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数,所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系,起始拷贝数越多,经过的循环数就越少,Ct值也就越小,反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间,过大和过小都将影响实验数据的精度。

4标准曲线

在绝对定量中,未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct值推算出。在实验过程中,我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释(5-6个稀释梯度),将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR实验中进行反应,将稀释标准品得到的Ct值构建标准曲线,通过标准曲线可以推算出未知样品的量。标准曲线的制作不需要人工操作,由仪器自动完成。理论上,一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距,如果PCR反应呈理想的方式扩增,产物在每一循环都加倍,荧光曲线之间的间距则符合等式“2n=稀释倍数”,n为2样本间Ct值差。例如:10倍稀释的样本,2n=10,可得n=3.32,Ct值差3.32。

5扩增效率

在绝对定量中,我们将已知模板稀释成一系列浓度梯度进行荧光PCR实验,利用拷贝数和Ct值做成标准曲线,利用递减的直线关系等式和相关系数(r)或可信度来计算扩增效率。

扩增效率与标准曲线的斜率相关,计算方程为:扩增效率(E)=10-1/斜率。理论上,在每个指数扩增循环中,PCR产物的量加倍,即PCR产物2倍增加,反应效率为2,扩增效率就为2,就可得2=10-1/斜率,标准曲线得斜率就为-3.32,斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。

如果将扩增效率用百分率来表示,即:E%=(E-1)×100%,对于理想的PCR反应,E=2,即:扩增效率E%=(2-1)×100%=100%

如果E=1.92,带入方程(1.92-1)×100%=92%,表示每个循环的终点,扩增产物的拷贝数增加1.92倍,或每次循环有92%的模板被扩增。

一般说来,扩增效率接近100%是优化的重复性好实验的最好标志,实际操作时,反应的扩增效率应该在90%-105%之间,如果扩增效率低,可能的原因是引物设计不当,或者反应条件未优化;扩增效率大于100%时,可能的原因是系列稀释样品加样错误,或者有非特异性产物扩增,如引物二聚体产生。用上述方法确定扩增效率时,反应体系中的抑制剂的出现也可能导致扩增效率明显增加,原因是高浓度模板样本中抑制剂的浓度低,导致反应的Ct值延迟出现,而低浓度模板样本中抑制剂浓度高,反应的Ct值延迟程度小,导致斜率的绝对值以及计算所得的扩增效率会增加。如果扩增效率小于90%或大于105%,建议重新设计引物或探针。

下面就说一说方法步骤、注意事项。

RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。

抽取RNA:

一、试剂准备
1.3M醋酸钠(pH 5.2)
2.0.1M NaOH
3.1×上样缓冲液:20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65
时,加入经65温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%。
4.洗脱缓冲液:10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS
5.无水乙醇、70%乙醇
6.DEPC
二、操作步骤
1.将0.5-1.0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2.用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管,将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-1ml,用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3.使用1×上样缓冲液洗柱,直至洗出液pH值小于8.0。
4.将RNA溶解于DEPC H2O中,在65
中温育10min左右,冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液,混匀后上柱,立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后,再用1×上样缓冲液洗柱,继续收集流出液。
5.将所有流出液于65
加热5min,冷却至室温后再次上柱,收集流出液。
6.用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱,每管1ml分部收集,OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高,其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7.用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA,分部收集,每部分为1/3-1/2柱体积。
8.OD260测定Poly(A+)RNA分布,合并含Poly(A+)RNA的收集管,加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)、2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20
放置30min。
9.4
离心,10000g×15min,小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意:此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4离心,10000g×5min,弃上清,室温晾干。
10. 用适量的DEPC H2O溶解RNA。
三、注意事项
1.整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2.步骤(4)中将RNA溶液置65
中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构,使Poly(A+)尾充分暴露,从而提高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
3.十二烷基肌氨酸钠盐在18
以下溶解度下降,会阻碍柱内液体流动,若室温低于18最好用LiCl替代NaCl。
4.寡聚(dT)-纤维素柱可在4
贮存,反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5.一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。 


RT:

一、实验器具的处理与准备
塑料制品:(包括吸头、EP管等)
将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中(必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水)37℃过夜,然后送至高压3次,后在80℃烘烤箱中烘干(或置于37℃中8小时左右烘干),试验前将枪头放入吸头台。
二、试剂配制和准备:
(1)DEPC水:泡实验器具的DEPC水的配制:1000ml双蒸水中加1mlDEPC,放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制:100ml盐水瓶内装40ml双蒸水,加40ulDEPC,37℃过夜,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2)RT中所需要的各种试剂
(3)引物浓度计算方法: (新合成的引物的稀释) 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积(ul)=(OD×33×1000000)/(分子量×X)
三、RT时注意事项:
为避免RNA酶污染,在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
四、RT步骤
用SSⅢ逆转录酶进行RT(20ul体积)
1, 准备0.65ml的EP管
2, 冰上操作:在EP管中加入10ulDEPC水,1ul引物,1ul模板RNA,1uldNTP,短暂离心。
3, 65℃水浴5分钟后,立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4, 短暂离心后,冰上操作:加入4ul 5×First-Strand Buffer,1ul 0.1MDTT,1ul RNAse Inhibitor,1ul SSⅢ逆转录酶。
5, 短暂离心
6, 50℃水浴60分钟进行逆转录。
7, 70℃水浴15分钟灭活逆转录酶
8, -20℃保存,或立即进行PCR。
用AMV逆转录酶进行RT(10ul体积)
1, 准备0.65mlEP管
2, 加入4.5ul DEPC水,1ul引物,1ul模板RNA
3, 稍离心,100℃沸水裕1min
4, 加入0.5uldNTP,2ul 5×Buffer,1ul AMV逆转录酶
5, 稍离心,封口膜封口,42℃水浴90℃作RT
6, 100℃沸水裕3min灭活AMV
7, 立即PCR或-20℃保存。


PCR:

一、准备工作
1、实验器具与材料:
(1)移液枪:200ul、10ul
(2)吸头:200ul、20ul
(3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个
(4)EP管1.5ml、100ul
2、实验器具的处理与准备
(1) 塑料制品:(包括吸头、EP管等)
送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。
3、试剂配制和准备:
(1) 双蒸水: 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水,送至高压,后分装到几个1.5mlEP管中,-20℃中保存备用。
(2) PCR中所需要的各种试剂
二、PCR时注意事项:
佩戴一次性手套,同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。
三、PCR步骤
1, 准备100ul EP管
2, 依次在管中加入:(50ul反应体系)
ddH2O 37.5ul ×?
10mM dNTP 1ul ×?
10×PCR buffer 5ul ×?
25mM Mgcl2 (加之前要摇匀) 3ul ×?
上游引物 1ul ×?
下游引物 1ul ×?
模板cDNA 1ul
3, 稍离心
4, 100℃沸水浴1分钟
5, 趁热加入Tag酶0.5ul(冰上操作)
6, 再加入50ul液体石蜡封闭
7, 10000rmp离心1分钟
8, PCR条件
94℃ 1min
58℃ 50sec
72℃ 1min30sec
进行40个循环,然后72℃ 10min 完后4℃保温。
9,10000rmp离心5min
10,将下层水相转入新的0.65mlEP管中,-20℃保存


荧光定量PCR:

荧光定量PCR体系准备:

PCR条件摸索(上述已经提及)

模板浓度:如果是首次实验,那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验条件摸索,以选择出最合适的模板浓度,条件困难时,也至少要选择两个稀释度(高或中、低浓度)来进行实验。一般而言,Ct值在15-30范围内比较合适,若大于30则应加大模板使用量,如果Ct小于15则应对模板进行稀释后再进行实验。

引物的浓度:引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素,若浓度太低,会致使反应不完全,若引物太多,则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应,可在0.1-1.0uM之间进行选择,直至得到满意的结果。

探针浓度:初次实验每个探针用0.2uM,如果信号强度达不到要求,可以适当增加至0.4uM

将已知浓度的HBV阳性标准品做系列浓度稀释,分别含有5×103、5×104、5×105、5×106 copies /ml,建立20ul反应体系(参照优化体系),3次重复(荧光PCR一般进行3次以上重复,有的甚至达到了6次以上重复)。

以某病人的血液提取的HBV病毒DNA为模板,建立20ul荧光定量PCR反应体系(参照优化体系),每个样品3次重复,同时设置不加模板的阴性对照。

6、荧光定量PCR体系配制及仪器程序设置

请参照各公司荧光定量PCR试剂、荧光定量PCR仪器说明书进行。

7、实验结果与数据处理QQ截图20160928102937.jpg

  目前相对定量普遍采用操作简便的2-△△Ct分析方法,下面就以此分析方法为例进行分析,应用SYBR Green方法对不同样本间X基因表达分析的详细说明和举例。

其他步骤前面已经赘述,再次略过,只讲一下数据分析:

1、溶解曲线绘制与分析

SYBR Green染料没有序列特异性,可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA上,因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解,称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中,随

着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点,实时仪器连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同,扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链,可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰与凝胶电泳中条带类似。

熔解曲线的设置是在整个PCR完成后进行,从60℃升至95℃,每升高1℃仪器会自动收集荧光信号,得到的熔解曲线是逐渐下降的过程,且在Tm值下降最快,为方便分析,我们将温度与荧光强度的变化求导,即得到单峰的熔解曲线,这样我们就可以证明引物的特异性良好,实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰。

问问.jpg

2数据处理

未处理样品 X基因 Mean Ct值 26.52 GAPDH基因 Mean Ct值 20.34  

药品处理  X基因 Mean Ct值 24.18 GAPDH基因 Mean Ct值 20.12

Blank    none            none

QQ截图20160928103726.jpg

下面我们来看看上面表格中差异倍数是如何得来的:

首先,分别求出6个重复样品X基因和GAPDH基因平均Ct值后,应用参照基因GAPDH对未处理样品和药物处理样品进行校正:QQ截图20160928103949.jpg

然后,对未处理样品和药物处理样品的▷Ct进行归一化:blob.png

最后,算出表达差异:blob.png


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