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蛋白质浓度的测定

作者: 9 (离线) 时间:2016-08-26 21:28:40  向他请教    返回小组

实验室常用的浓度测定有三种方法:BCA法和紫外法(280nm吸收)用于定量测定,Bradford法则用于定性测定。

BCA

材料

Thermo Pierce BCA 蛋白质浓度测定试剂盒;2 mg/ml BSA

蛋白溶液内含有的DTT或是b-巯基乙醇,会影响测量结果,所以含有这两种还原剂的样品,不使用BCA方法,具体情况参看说明书。

步骤

1. BCA试剂由A液和B液组成,使用前按50:1体积比混合成工作液;每个反应体系一般使用0.5 ml BCA工作试剂;实验前计算好所需的工作液体积(注意不同的缓冲液需要分别的空白对照),工作液总体积=(样品数+对照数)×0.5 ml

2. 如果需要制作标准曲线,可以参考下表,配制不同浓度的BSA,对标准样品做线性拟合获得吸收值与蛋白浓度的对应关系。若不需很准确的定量,可以使用以前做的标准曲线。

2 mg/ml BSA(μl)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

H2O(μl)

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

Total(μl)

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

 

3. 配制25 μl待测蛋白样品,蛋白总量在15 μg(150 μg)左右较为合适。

4. 25 μl样品到0.5 ml混合均匀的工作液中,把同体积的蛋白质缓冲液加到另一份工作液中,作为空白对照;37反应30 min后测量A562,计算蛋白浓度。

紫外吸收法

1. 用软件(比如http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html)预测给定序列的蛋白质在280 nm处的消光系数ε

2. 根据消光系数选择合适的蛋白质终浓度(使得0.1≤A280≤0.8),将合适体积的蛋白质溶液稀释到8 M尿素或6 M盐酸胍中(体积比不要超过1:10),同样的buffer按相同比例稀释到8 M尿素或6 M盐酸胍中,作为空白对照,测定A280;使用Eppendorf BioPhotometer分光光度计,还会给出A260A320,可以判断核酸污染和溶液浊度;

3. 根据c= A280/(εb)计算浓度,其中光程b=1.0 cmε为消光系数。


 

 

Bradford法定性估计蛋白质含量

Bradford试剂配制

50 mg考马斯亮蓝G-250溶解于50 ml无水乙醇中,加入100 ml 83%磷酸。再加入到500 ml水中,0.22 μm抽滤除去杂质,最后加 350 ml水,4储存。

使用方法

200 μl Bradford试剂,加入10 μl待测样品,观察亮蓝色的形成,或者测量A595;也可以用BSA做标准曲线,估计蛋白质浓度。

注意事项

1. Bradford试剂主要与精氨酸和其他几种残基侧链反应显色,序列依赖性较大,适于定性估计蛋白质,常用在蛋白纯化过程中。

2. 一些试剂(比如Triton X-100)也会使Bradford试剂显色,干扰检测。



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